Nat. Commun. | 揭示不同分子途径调控温度依赖性秆锈病抗性基因
小麦秆锈病由真菌病原体Puccinia graminis f. sp. tritici（Pgt）引起，是全球范围内造成小麦严重损失的重大病害。历史上，秆锈病曾在温暖天气下引发洲际规模的大流行。尽管通过育种已部署了多种抗性（Sr）基因，但病原体毒性变异株的不断出现使得许多抗性基因（如曾广泛有效的Sr6）失效。一些Sr基因表现出温度依赖性的免疫反应，例如Sr6在低温下抗性增强，而Sr13和Sr21则在高温下抗性增强。深入理解这些温度敏感型抗性基因的作用机制，对于应对气候变化背景下的小麦生产安全具有重要意义。
澳大利亚联邦科学与工业研究组织（CSIRO）农业与食品部、美国农业部农业研究局（USDA-ARS）谷物病害实验室、悉尼大学植物育种研究所等机构的科研人员合作，在《Nature Communications》杂志发表了题为“Divergent molecular pathways govern temperature-dependent wheat stem rust resistance genes”的论文。该研究通过诱变和抗性基因富集测序（MutRenSeq）成功克隆了小麦中一个重要的温度敏感型秆锈病抗性基因Sr6，并鉴定其编码一个含有整合BED结构域的核苷酸结合位点-富含亮氨酸重复序列（NLR）蛋白。研究进一步发现，Sr6基因的温度敏感性可以被转移到转基因小麦中。对携带不同温度敏感型抗性基因（Sr6, Sr13, Sr21）的近等基因系在不同温度下接种Pgt后的差异基因表达分析表明，低温有效的Sr6与高温有效的Sr13和Sr21所激活的分子途径存在显著差异。
主要研究结果介绍
Sr6基因的克隆与鉴定
研究团队首先利用化学诱变剂EMS处理含有Sr6基因的小麦代换系Chinese Spring*5/Red Egyptian 2D (CS/RE 2D)，筛选到7个感病突变体。通过MutRenSeq技术对这些突变体和野生型进行测序分析，初步鉴定出两个可能连锁的包含SNP的重叠群（contigs），分别带有NB-ARC、LRR结构域或仅LRR结构域。进一步的Sanger测序和5'RACE实验确认了这两个重叠群实际上属于同一个基因，并在所有7个突变体中均发现了点突变（图1A）。该基因编码一个包含N端卷曲螺旋（CC）、NB-ARC、LRR结构域以及一个非典型的整合锌指BED结构域的NLR蛋白。基于该候选基因序列设计的显性PCR标记Sr6STS1在已知携带Sr6的品系中表现出特异性，并在CS × CS/RE 2D的F₃分离群体中与抗病表型共分离。 进一步对Sr6候选基因的全基因组序列进行分析，发现其在Landmark和Claire两个小麦品种的2D染色体上存在100%匹配的序列。Sr6蛋白的AlphaFold结构预测显示其包含三个亚结构域：N端的BED基序、NB-ARC结构域和LRR结构域（图1B）。与其他已知的6个与抗病相关的BED-NLR蛋白（如水稻Xa1、大麦Rph15）相比，Sr6在N端具有相同的CC-BED模块，暗示了BED-NLR蛋白在结构上的保守性。尽管SR6全长蛋白序列与其他已知的BED-NLR蛋白差异较大，但其BED结构域序列在陆生植物中高度保守。
图1
Sr6基因的转基因互补验证其温度敏感性抗性
为了最终确认候选基因为Sr6并验证其温度敏感性，研究者将包含自身调控元件的Sr6基因转入感病小麦品种Westonia。获得的两个独立T₀代转基因植株的T₁代和T₂代后代在低温（18°C）和高温（25°C）条件下接种Sr6-非致病毒株Pgt race 21-0。 结果显示，在低温（18°C）条件下，转基因阳性植株表现出明显的抗病性（坏死斑点或小脓疱被坏死环包围），与携带内源Sr6的对照类似；而在高温（25°C）条件下，所有转基因植株均表现为感病（图2A）。统计分析显示，在18°C时，Sr6阳性转基因植株的产孢面积百分比（PSA）显著低于阴性植株（p=0.000074）；而在25°C时两者无显著差异（p=0.75）（图2B）。这一结果清晰地证明了克隆的Sr6基因能够赋予小麦温度敏感性的秆锈病抗性，且这种温度敏感性由Sr6基因本身介导。
图2
不同温度敏感型Sr基因调控差异化的分子途径
为了探究不同温度敏感型Sr基因在不同温度下的分子响应机制，研究团队选择了携带Sr6（低温有效）、Sr13（高温有效）或Sr21（高温有效）的近等基因系（NILs）以及感病轮回亲本LMPG，在18°C和25°C条件下接种Pgt race MCCFC（对三者均无毒），并进行了RNA-seq和qPCR分析。
表型观察：LMPG在两种温度下均感病。Sr6-NIL在18°C高度抗病，在25°C感病。Sr13-NIL和Sr21-NIL则表现出相反的模式，在25°C下更抗病（图3）。
Sr*基因自身表达：Sr6在低温下表达上调。Sr13在高温下第3天表达上调，但在低温下第1天表达上调而第3天表达下调。Sr21*在两种温度下均表达上调（补充图7）。
病程相关（PR）基因和茉莉酸（JA）途径基因表达：在导致更强抗性的温度条件下（Sr6为低温，Sr13和Sr21为高温），6个PR基因（PR1, PR2, PR3, PR4, PR5, PR9）和4个JA途径基因的表达模式存在显著差异。总体而言，在Sr6系中，PR基因在低温下显著上调；而在Sr13和Sr21系中，PR基因的上调主要发生在高温条件下（补充图8-10）。
全局转录组分析：RNA-seq结果显示，在三种NILs中，与感病亲本LMPG相比，共有57至872个基因在不同温度和时间点上调（补充图11）。qPCR验证了8个在所有三个NILs中均独特表达的上调基因，包括水通道蛋白PIP1、光合系统II氧释放增强子蛋白2（OEE-2）、叶绿素a/b结合蛋白（CBP）和α-淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂样蛋白（AAMY）（补充图12）。这些基因在不同Sr系和不同温度下的表达模式各异，表明不同Sr基因在不同温度下激活了不同的防御反应网络。 GO富集分析显示，在Sr6系中，低温条件下与真菌感染防御反应、生物胁迫响应和病原体抗性相关的基因显著富集。而在Sr13系中，高温条件下与核糖体小亚基组装、碳利用和光合作用相关的途径显著上调。对于Sr21系，在高温和低温下均有质子跨膜转运相关的基因上调。这些结果清晰地表明，Sr6、Sr13和Sr21在各自发挥抗性的最佳温度条件下，激活了不同的分子途径。
图3
蛋白结构比较与启动子分析
对SR6、SR13和SR21蛋白的AlphaFold结构预测显示，三者均具有典型的NLR蛋白结构域，但其N端结构存在显著差异（补充图22）。SR6具有BED结构域，SR13具有经典的CC结构域，而SR21的N端则形成一个额外的螺旋。尽管N端结构不同，但三者的α3螺旋均是物理上最接近LRR结构域的单元。对SR6的锌指BED基序与其他已知BED-NLR蛋白的比较显示，其结构高度保守（补充图24）。然而，整体蛋白结构比较未能揭示与抗性温度敏感性相关的明显结构特征。 对三个基因启动子区域的顺式作用元件分析发现，仅Sr13的启动子区域含有一个已知的低温响应元件（LTR motif CCGAAA）（补充数据6）。亚细胞定位实验显示，SR6、SR13和SR21的全长蛋白或其N端结构域在18°C和25°C下均主要定位于细胞核和细胞质，温度对其定位无显著影响（补充图25）。
全文总结与展望
本研究成功克隆了小麦中一个重要的温度敏感型秆锈病抗性基因Sr6，并阐明了其与另外两个已克隆的温度敏感型抗性基因Sr13和Sr21在分子响应机制上的差异。Sr6编码一个含有整合BED结构域的NLR蛋白，其抗性在低温下增强，高温下减弱，这种特性可以由单个Sr6基因介导。 通过比较不同温度下、携带不同Sr基因的近等基因系在接种病原菌后的基因表达谱，研究揭示了这些基因在各自最优抗性温度条件下激活了不同的分子途径。低温有效的Sr6主要上调与直接防御反应相关的基因，而高温有效的Sr13则更多地上调与基础代谢和光合作用相关的基因。这表明，植物针对不同环境温度下的病原体入侵，进化出了多样化的免疫调控策略。 这些发现不仅加深了对植物温度敏感型免疫反应分子基础的理解，也为未来应对气候变化背景下的作物病害抗性育种和基因工程改造提供了新的思路和靶点。例如，可以考虑将不同温度效应的抗性基因进行聚合，以期获得在更宽温度范围内均有效的广谱抗性。同时，对这些不同分子途径中关键调控因子的深入研究，有望为设计新型抗病策略提供理论依据。
本文的共同第一作者是Tim C. Hewitt¹˒⁸˒¹⁰, Keshav Sharma²˒¹⁰和张建平³˒⁴˒¹⁰。通讯作者为Robert McIntosh³, Evans Lagudah¹˒³, Peng Zhang³和Matthew N. Rouse²˒⁹。 作者单位遍布澳大利亚CSIRO、美国USDA-ARS、悉尼大学、中国河南农业大学以及美国和加拿大的多所大学和研究机构。
该研究得到了澳大利亚谷物研究与发展公司（GRDC）、澳大利亚研究理事会（ARC）以及美国农业部国家植物病害恢复系统等的资助。
https://doi.org/10.1038/s41467-025-60030-x
小麦族多组学网站：http://wheatomics.sdau.edu.cn
投稿、合作等邮箱：shengweima@icloud.com
（转自：小麦研究联盟）
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